在芝加哥大学第五任校长罗伯特·梅纳德·哈钦斯（Robert M. Hutchins）在任的24年里，芝加哥大学经历了许多重大变革。哈钦斯提出了旨在防止学术课程和职业课程过分专门化的“芝加哥计划”，对其他美国大学的本科通识教育产生了巨大影响，他建立了沿用至今的本科生核心课程（Common Core），并将研究学院重组为四个学部。 在他的带领下，芝大平稳渡过了美国经济大萧条（1929年-1933年）。
第二次世界大战期间，芝大在曼哈顿计划中扮演了重要角色。这一时期，大批物理学家聚集芝大，奠定了该校在自然科学界的地位。
作为曼哈顿计划的一部分，由加州大学伯克利分校化学家格伦·西奥多·西博格（Glenn T. Seaborg）带领团队在芝加哥大学乔治·赫伯特·琼斯实验室（George Herbert Jones Laboratory）于1942年9月首次分离并测量出94号放射性元素钚；之后，95号元素镅、96号元素锔也在芝大被化学认定。而在1942年12月2日，著名物理学家恩利克·费米及其助手们在芝加哥大学Stagg Field Stadium内建成了世界上第一座可控核反应堆，命名为“芝加哥一号堆” （Chicago Pile-1），成功产生可控的核裂变链式反应，而这一成就是原子能时代的一个重要里程碑，为1945年的原子弹的成功爆炸奠定了基础，芝加哥大学也因此被称为“原子能诞生地”。
20世纪60年代，随着美国反战运动以及女权主义的兴起，芝大校园内的学生运动进入高潮。1962年，学生占领校长办公室以抗议学校租赁政策。1969年，为抗议学校开除左翼作家马琳·迪克森，400名学生占领行政大楼达两周之久。
